Eukariotyczny system ekspresji przejściowej oparty na rekombinowanym wirusie krowianki

DNA kodujący polimerazę RNA bakteriofaga T7 zligowano z promotorem transkrypcji wirusa krowianki i zintegrowano z genomem wirusa krowianki. Rekombinowany wirus krowianki zachował zakaźność i stabilnie wyrażał polimerazę RNA T7 w komórkach ssaków . Geny docelowe skonstruowano poprzez wstawienie segmentów DNA kodujących beta – galaktozydazę lub acetylotransferazę chloramfenikolu do plazmidu z regionami promotora i terminatora bakteriofaga T7.

Gdy komórki zakażono rekombinowanym wirusem krowianki i transfekowano plazmidami zawierającymi docelowe geny, te ostatnie ulegały ekspresji na wysokim poziomie. Aktywność acetylotransferazy chloramfenikolu była 400-600 razy większa niż ta obserwowana w konwencjonalnych systemach ekspresji przejściowej u ssaków, regulowanych przez regiony wzmacniacza i promotora długich powtórzeń końcowych wirusa mięsaka Rousa lub przez wczesny region wirusa 40 małpy. Hybrydowy wirus krowianki/T7 stanowi podstawę prostego, szybkiego, szeroko stosowanego i wydajnego systemu ekspresji u ssaków.

Powiązane z BRAFE600 zatrzymanie cyklu komórkowego przypominającego proces starzenia się ludzkich znamion.

Większość normalnych komórek ssaków ma skończoną długość życia, co uważa się za mechanizm ochronny przed nieograniczoną proliferacją. Zjawisko to, zwane starzeniem się, jest napędzane przez ścieranie telomerów, które wyzwalają indukcję supresorów guza, w tym p16(INK4a) (ref. 5). W hodowanych komórkach starzenie się może być wywołane przedwcześnie przez onkogeny; jednak od dawna dyskutowano, czy takie indukowane przez onkogeny starzenie się stanowi proces fizjologiczny.
Znamiona ludzkie (mole) są łagodnymi nowotworami melanocytów, które często zawierają mutacje onkogenne (głównie V600E, gdzie walina zastępuje kwas glutaminowy) w BRAF, kinazie białkowej i efektorze w dół Ras.
Niemniej jednak znamiona zwykle pozostają w stanie zahamowania wzrostu przez dziesięciolecia i rzadko przechodzą w nowotwór złośliwy (czerniak). Rodzi to pytanie, czy znamiona ulegają starzeniu indukowanemu przez BRAF(V600E).
Tutaj pokazujemy, że trwała ekspresja BRAF(V600E) w ludzkich melanocytach indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego, któremu towarzyszy indukcja zarówno p16(INK4a), jak i związanej ze starzeniem się aktywności kwaśnej beta – galaktozydazy (SA -beta- Gal) , powszechnie stosowanej marker starzenia.
Po walidacji tych wyników in vivo, znamiona wrodzone są niezmiennie pozytywne dla SA -beta- Gal, co wskazuje na obecność tego klasycznego markera związanego ze starzeniem się w przypadku zmiany nowotworowej u człowieka w dużej mierze z zahamowanym wzrostem. W melanocytach z zahamowanym wzrostem, zarówno in vitro, jak i in situ, zaobserwowaliśmy wyraźną mozaikową indukcję p16(INK4a), co sugeruje, że czynniki inne niż p16(INK4a) przyczyniają się do ochrony przed proliferacją sterowaną przez BRAF(V600E).
Naevi nie wydaje się cierpieć z powodu ścierania się telomerów, argumentując za aktywnym procesem starzenia się, napędzanym przez onkogeny, a nie utratą potencjału replikacyjnego.
Tak więc, zarówno in vitro, jak i in vivo, melanocyty z ekspresją BRAF(V600E) wykazują klasyczne cechy starzenia, co sugeruje, że starzenie się indukowane przez onkogen reprezentuje prawdziwy ochronny proces fizjologiczny.

Fuzje genów in vitro, które łączą aktywny enzymatycznie segment beta – galaktozydazy z fragmentami na końcu aminowym białek egzogennych: wektory plazmidowe Escherichia coli do wykrywania i klonowania sygnałów inicjacji translacji.

Przedstawiamy konstrukcję i zastosowanie serii wektorów plazmidowych odpowiednich do wykrywania i klonowania sygnałów kontrolnych translacji i sekwencji kodujących 5′ genów pochodzenia egzogennego.
W plazmidach tych usunięto pierwsze osiem kodonów końca aminowego genu beta – galaktozydazy operonu laktozy , lacZ, a unikalne miejsca cięcia endonukleaz BamHI, EcoRI i SmaI (XmaI) zostały włączone w sąsiedztwie ósmego kodonu lacZ.
Wprowadzenie do takich plazmidów fuzyjnych lac fragmentów kwasu dezoksyrybonukleinowego zawierających odpowiednie sygnały regulatorowe i sekwencje kodujące 5′ doprowadziło do wytworzenia białek hybrydowych składających się z karboksylokońcowego segmentu pozostałości beta – galaktozydazy oraz fragmentu peptydu zawierającego aminokońcową grupę aminową kwasy kodowane przez egzogenną sekwencję kwasu dezoksyrybonukleinowego.
Te peptydy hybrydowe zachowały aktywność enzymatyczną beta – galaktozydazy i dały fenotyp Lac+. Takie białka hybrydowe są przydatne do oczyszczania sekwencji peptydowych kodowanych przez egzogenne fragmenty kwasu dezoksyrybonukleinowego oraz do badań dotyczących struktury i funkcji określonych segmentów peptydowych.

Pułapki promotorowe w embrionalnych komórkach macierzystych: genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji i mutacji genów rozwojowych u myszy.

Opracowano ogólną strategię selekcji mutacji insercyjnych u myszy. Konstrukty pozbawione promotora i zawierające gen beta – galaktozydazy lub gen reporterowy kodujący białko o aktywności zarówno beta – galaktozydazy , jak i fosfotransferazy neomycyny , zostały zaprojektowane tak, aby aktywacja genu reporterowego zależała od jego wstawienia w aktywną jednostkę transkrypcyjną. Takie zdarzenia insercyjne tworzą mutację w znakowanym genie i umożliwiają pójście za jego ekspresją aktywności beta – galaktozydazy .
Wprowadzenie konstruktów pułapki promotorowej do embrionalnych komórek macierzystych (ES) przez elektroporację lub infekcję retrowirusową doprowadziło do wyprowadzenia linii transgenicznych, które wykazują różne wzorce ekspresji beta – galaktozydazy . Krzyżowanie heterozygot z 24 szczepów, w których zachodzi ekspresja beta – galaktozydazy , pozwoliło zidentyfikować 9 szczepów, w których homozygotyczność prowadzi do śmiertelności embrionalnej. Ponieważ w pozostałych szczepach nie wykryto jawnego fenotypu, wyniki te sugerują, że znaczna część genów ssaków zidentyfikowanych za pomocą tego podejścia nie jest niezbędna do rozwoju.

Mapowanie sygnalizacji Wnt/ beta- katenina podczas rozwoju myszy iw nowotworach jelita grubego.

Sygnalizacja beta- kateniny Wnt odgrywa kluczową rolę w kilku procesach rozwojowych i patologicznych. Domeny ekspresji Wnt były szeroko badane u myszy, ale tkanki odbierające sygnał pozostają w dużej mierze niezidentyfikowane.
Aby określić, które komórki reagują na aktywowaną beta- kateninę podczas rozwoju ssaków, wygenerowaliśmy transgen aktywowany przez beta -kateninę, kierujący ekspresją jądrowych myszy transgenicznych z receptorem beta – galaktozydazy (BAT-gal), eksprymujących gen lacZ pod kontrolą beta- kateniny T elementy reagujące na czynnik komórkowy.
Aktywność genu reporterowego znajduje się w znanych ośrodkach organizacyjnych, takich jak granica śródmózgowia i ektodermalny grzbiet wierzchołka kończyny. Co więcej, ekspresja BAT-gal identyfikuje nowe miejsca sygnalizacji Wnt, takie jak struna grzbietowa, śródbłonek i obszary mózgu dorosłego, ujawniając nieoczekiwany dynamiczny wzór aktywności transkrypcyjnej beta- kateniny . Ekspresję transgenu analizowano na zmutowanych tłach.
U homozygotycznych myszy 6-null związanych z receptorem lipoproteinowym, które nie mają koreceptora Wnt, barwienie BAT-gal nie występuje w zmutowanych tkankach, co wskazuje, że myszy BAT-gal są bona fide wskaźnikami sygnalizacji Wnt beta- kateniny in vivo.
Analizy ekspresji BAT-gal w tle gruczolakowatej polipowatości jelita grubego (rozwój jelita grubego+) wykazały aktywność transkrypcyjną beta- kateniny w gruczolakach jelit, ale zaskakująco nie w normalnych komórkach krypt.

Beta Galactosidase (?-Gal) Activity Assay Kit (Fluorometric)
K821-100	Biovision	each	601.2 EUR
beta Galactosidase antibody
70C-CR7001CAP	Fitzgerald	100 ug	516 EUR
beta Galactosidase antibody
70R-10653	Fitzgerald	400 ul	516 EUR
beta-Galactosidase Antibody
5155-002mg	ProSci	0.02 mg	206.18 EUR
beta-Galactosidase Antibody
5155-01mg	ProSci	0.1 mg	523.7 EUR
beta-Galactosidase Peptide
5155P	ProSci	0.05 mg	197.7 EUR
Beta galactosidase antibody
70R-51282	Fitzgerald	100 ul	292.8 EUR
beta Galactosidase antibody
20C-CR7001RP	Fitzgerald	1 mg	117.6 EUR
beta Galactosidase antibody
20C-CR7001RP2	Fitzgerald	2 mg	240 EUR
beta Galactosidase antibody
20C-CR7001RP5	Fitzgerald	5 mg	326.4 EUR
beta Galactosidase antibody
20-BR21	Fitzgerald	2 mL	568.8 EUR
beta Galactosidase antibody
20R-GR016	Fitzgerald	10 mg	442.8 EUR
beta Galactosidase antibody
10C-CR7001M2	Fitzgerald	100 ug	163.2 EUR
beta Galactosidase antibody
10R-G122a	Fitzgerald	1 mg	398.4 EUR
beta-Galactosidase Antibody
24889-100ul	SAB	100ul	468 EUR
beta Galactosidase protein
30-AB21	Fitzgerald	1000 units	258 EUR
beta Galactosidase Enzyme
abx070004-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Beta-Galactosidase Antibody
3231-100	Biovision	each	418.8 EUR
Beta-Galactosidase Antibody
3231-30T	Biovision	each	175.2 EUR
Alpha Galactosidase (?-Gal) Activity Assay Kit (Fluorometric)
K407-100	Biovision	each	633.6 EUR
Beta Galactosidase Staining Kit
55R-1541	Fitzgerald	250 assays	444 EUR
beta Galactosidase antibody (biotin)
60R-1083	Fitzgerald	2 mg	165.6 EUR
Anti-Galactosidase beta Antibody
A01829	BosterBio	100ul	476.4 EUR
beta-Galactosidase Recombinant Protein
91-428	ProSci	0.05 mg	714.3 EUR
beta Galactosidase (GLB1) Antibody
abx140220-01mg	Abbexa	0.1 mg	460.8 EUR
beta Galactosidase (GLB1) Antibody
20-abx141121	Abbexa	427.20 EUR 644.40 EUR 260.40 EUR	100 ul 200 ul 30 ul
beta Galactosidase Blocking Peptide
20-abx061819	Abbexa	309.60 EUR 460.80 EUR	1 mg 5 mg
beta Galactosidase Blocking Peptide
20-abx064157	Abbexa	326.40 EUR 493.20 EUR	1 mg 5 mg
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx101619	Abbexa	477.60 EUR 159.60 EUR 1328.40 EUR 644.40 EUR 376.80 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx101620	Abbexa	493.20 EUR 159.60 EUR 1362.00 EUR 661.20 EUR 376.80 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx101621	Abbexa	510.00 EUR 159.60 EUR 1412.40 EUR 693.60 EUR 393.60 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Galactosidase Beta Polyclonal Antibody
ABP57427-003ml	Abbkine	0.03ml	189.6 EUR
Galactosidase Beta Polyclonal Antibody
ABP57427-01ml	Abbkine	0.1ml	346.8 EUR
Galactosidase Beta Polyclonal Antibody
ABP57427-02ml	Abbkine	0.2ml	496.8 EUR
beta Galactosidase (GLB1) Antibody
20-abx007866	Abbexa	360.00 EUR 526.80 EUR 226.80 EUR	100 ul 200 ul 30 ul
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
20-abx001538	Abbexa	493.20 EUR 710.40 EUR 218.40 EUR 376.80 EUR	100 ul 200 ul 20 ul 50 ul
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
abx122700-100ug	Abbexa	100 ug	469.2 EUR
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
20-abx112659	Abbexa	878.40 EUR 477.60 EUR	150 ul 50 ul
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
20-abx014265	Abbexa	376.80 EUR 117.60 EUR 477.60 EUR 594.00 EUR	100 ug 10 ug 200 ug 300 µg
beta D Galactosidase Antibody
abx022826-10mg	Abbexa	10 mg	910.8 EUR
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
abx029610-400ul	Abbexa	400 ul	627.6 EUR
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
abx029610-80l	Abbexa	80 µl	343.2 EUR
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody
20-abx333660	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
abx330975-100ul	Abbexa	100 ul	510 EUR
Beta Galactosidase (GLB1) Antibody
abx230877-100ug	Abbexa	100 ug	610.8 EUR
Beta-Galactosidase Assay Kit
abx298865-100Assays	Abbexa	100 Assays	679.2 EUR
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
20-abx302353	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody
20-abx324974	Abbexa	376.80 EUR 292.80 EUR	100 ug 50 ug
beta Galactosidase (GLB1) Antibody
abx415199-02mg	Abbexa	0.2 mg	678 EUR
beta Galactosidase (GLB1) Antibody
abx411927-01mg	Abbexa	0.1 mg	710.4 EUR
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx172501	Abbexa	944.40 EUR 493.20 EUR	1 mg 200 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx176533	Abbexa	1479.60 EUR 710.40 EUR	1 mg 200 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx176534	Abbexa	1545.60 EUR 744.00 EUR	1 mg 200 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx176535	Abbexa	1646.40 EUR 777.60 EUR	1 mg 200 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody
20-abx176536	Abbexa	1796.40 EUR 844.80 EUR	1 mg 200 ug
Anti-Beta galactosidase antibody
PAab00877	Lifescience Market	100 ug	463.2 EUR
anti- Beta galactosidase antibody
FNab00877	FN Test	100µg	658.5 EUR
Beta-Galactosidase Staining Kit
K2182-250	ApexBio	250 assays	351.6 EUR
Recombinant Galactosidase Beta (GLb)
4-RPA196Hu01	Cloud-Clone	378.05 EUR 224.40 EUR 1087.68 EUR 442.56 EUR 765.12 EUR 328.80 EUR 2539.20 EUR	100 ug 10ug 1 mg 200 ug 500 ug 50ug 5 mg
Recombinant Galactosidase Beta (GLb)
4-RPA196Mu01	Cloud-Clone	528.58 EUR 265.20 EUR 1652.16 EUR 630.72 EUR 1141.44 EUR 429.60 EUR 3950.40 EUR	100 ug 10ug 1 mg 200 ug 500 ug 50ug 5 mg
Recombinant Galactosidase Beta (GLb)
4-RPA196Ra01	Cloud-Clone	595.24 EUR 283.20 EUR 1902.14 EUR 714.05 EUR 1308.10 EUR 474.00 EUR 4575.36 EUR	100 ug 10ug 1 mg 200 ug 500 ug 50ug 5 mg
Anti-Galactosidase beta antibody
STJ97628	St John's Laboratory	200 µl	236.4 EUR
Beta-Galactosidase Staining Kit
K802-250	Biovision	each	352.8 EUR
Recombinant E.coli Galactosidase-Beta 1
7-02812	CHI Scientific	10µg	Ask for price
Recombinant E.coli Galactosidase-Beta 1
7-02813	CHI Scientific	50µg	Ask for price
Recombinant E.coli Galactosidase-Beta 1
7-02814	CHI Scientific	1mg	Ask for price
Anti-GLB1/Beta-galactosidase Antibody
A01829-2	BosterBio	100ug/vial	400.8 EUR
Anti-GLB1/Beta-galactosidase Antibody
A01829-3	BosterBio	100ug/vial	400.8 EUR
Human Galactosidase Beta (GLb) Protein
20-abx066717	Abbexa	543.60 EUR 276.00 EUR 1479.60 EUR 627.60 EUR 393.60 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Mouse Galactosidase Beta (GLb) Protein
20-abx066718	Abbexa	744.00 EUR 326.40 EUR 2230.80 EUR 878.40 EUR 543.60 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Rat Galactosidase Beta (GLb) Protein
20-abx066719	Abbexa	828.00 EUR 343.20 EUR 2565.60 EUR 994.80 EUR 594.00 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
E.coli Galactosidase beta 1 (Recombinant)
20-abx073044	Abbexa	276.00 EUR 2798.40 EUR 393.60 EUR	10 ug 1 mg 50 ug
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody (HRP)
20-abx333661	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody (FITC)
20-abx333662	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody (Biotin)
20-abx333663	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody (FITC)
20-abx273830	Abbexa	543.60 EUR 292.80 EUR 1545.60 EUR 744.00 EUR 410.40 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Galactosidase Beta (GLb) Antibody (Biotin)
20-abx271946	Abbexa	510.00 EUR 276.00 EUR 1429.20 EUR 693.60 EUR 393.60 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody (HRP)
20-abx316908	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody (FITC)
20-abx316909	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody (Biotin)
20-abx316910	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
Bacteria beta Galactosidase (GLB1) Protein
abx670038-5mg	Abbexa	5 mg	526.8 EUR
Cow Galactosidase Beta (GLb) Protein
20-abx653492	Abbexa	777.60 EUR 326.40 EUR 2397.60 EUR 927.60 EUR 560.40 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Dog Galactosidase Beta (GLb) Protein
20-abx653493	Abbexa	777.60 EUR 326.40 EUR 2397.60 EUR 927.60 EUR 560.40 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Zebrafish Galactosidase Beta (GLb) Protein
20-abx653494	Abbexa	777.60 EUR 326.40 EUR 2397.60 EUR 927.60 EUR 560.40 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Monkey Galactosidase Beta (GLb) Protein
20-abx653495	Abbexa	777.60 EUR 326.40 EUR 2397.60 EUR 927.60 EUR 560.40 EUR	100 ug 10 ug 1 mg 200 ug 50 ug
Anti-Galactosidase beta L3 antibody
STJ93200	St John's Laboratory	200 µl	236.4 EUR
Human beta-galactosidase(beta-GAL)ELISA Kit
YLA0572HU-48T	Shanghai YL Biotech	48T	435 EUR
Human beta-galactosidase(beta-GAL)ELISA Kit
YLA0572HU-96T	Shanghai YL Biotech	96T	562.5 EUR
Beta Secretase Activity Assay Kit
55R-1383	Fitzgerald	100 assays	1002 EUR
Beta Hexosaminidase Activity Assay Kit
MET-5095	Cell Biolabs	100 assays	609.6 EUR
Anti-beta-Galactosidase (E. coli) Purified
11-261-C025	ExBio	0.025 mg	129.6 EUR
Anti-beta-Galactosidase (E. coli) Purified
11-261-C100	ExBio	0.1 mg	212.4 EUR
Human Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit
20-abx151616	Abbexa	7970.40 EUR 4250.40 EUR 990.00 EUR	10 × 96 tests 5 × 96 tests 96 tests
Human Galactosidase Beta (GLb) CLIA Kit
abx196673-96tests	Abbexa	96 tests	990 EUR
Mouse beta-Galactosidase (bGAL) CLIA Kit
abx196748-96tests	Abbexa	96 tests	990 EUR
Mouse Galactosidase, Beta (GLb) CLIA Kit
abx196965-96tests	Abbexa	96 tests	990 EUR
Rat Galactosidase, Beta (GLb) CLIA Kit
abx196966-96tests	Abbexa	96 tests	990 EUR
Rabbit Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit
abx362799-96tests	Abbexa	96 tests	990 EUR
Sheep Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit
abx364708-96tests	Abbexa	96 tests	1111.2 EUR
Pig Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit
abx361402-96tests	Abbexa	96 tests	990 EUR

Podsumowując, myszy BAT-gal ujawniają całą złożoność sygnalizacji beta- kateniny Wnt u ssaków i mają szerokie możliwości zastosowania do identyfikacji populacji komórek reagujących na Wnt w rozwoju i chorobie.