Eukariotyczny system ekspresji przejściowej oparty na rekombinowanym wirusie krowianki
Pawel
- 0
DNA kodujący polimerazę RNA bakteriofaga T7 zligowano z promotorem transkrypcji wirusa krowianki i zintegrowano z genomem wirusa krowianki. Rekombinowany wirus krowianki zachował zakaźność i stabilnie wyrażał polimerazę RNA T7 w komórkach ssaków . Geny docelowe skonstruowano poprzez wstawienie segmentów DNA kodujących beta – galaktozydazę lub acetylotransferazę chloramfenikolu do plazmidu z regionami promotora i terminatora bakteriofaga T7.
Gdy komórki zakażono rekombinowanym wirusem krowianki i transfekowano plazmidami zawierającymi docelowe geny, te ostatnie ulegały ekspresji na wysokim poziomie. Aktywność acetylotransferazy chloramfenikolu była 400-600 razy większa niż ta obserwowana w konwencjonalnych systemach ekspresji przejściowej u ssaków, regulowanych przez regiony wzmacniacza i promotora długich powtórzeń końcowych wirusa mięsaka Rousa lub przez wczesny region wirusa 40 małpy. Hybrydowy wirus krowianki/T7 stanowi podstawę prostego, szybkiego, szeroko stosowanego i wydajnego systemu ekspresji u ssaków.
Powiązane z BRAFE600 zatrzymanie cyklu komórkowego przypominającego proces starzenia się ludzkich znamion.
- Większość normalnych komórek ssaków ma skończoną długość życia, co uważa się za mechanizm ochronny przed nieograniczoną proliferacją. Zjawisko to, zwane starzeniem się, jest napędzane przez ścieranie telomerów, które wyzwalają indukcję supresorów guza, w tym p16(INK4a) (ref. 5). W hodowanych komórkach starzenie się może być wywołane przedwcześnie przez onkogeny; jednak od dawna dyskutowano, czy takie indukowane przez onkogeny starzenie się stanowi proces fizjologiczny.
- Znamiona ludzkie (mole) są łagodnymi nowotworami melanocytów, które często zawierają mutacje onkogenne (głównie V600E, gdzie walina zastępuje kwas glutaminowy) w BRAF, kinazie białkowej i efektorze w dół Ras.
- Niemniej jednak znamiona zwykle pozostają w stanie zahamowania wzrostu przez dziesięciolecia i rzadko przechodzą w nowotwór złośliwy (czerniak). Rodzi to pytanie, czy znamiona ulegają starzeniu indukowanemu przez BRAF(V600E).
- Tutaj pokazujemy, że trwała ekspresja BRAF(V600E) w ludzkich melanocytach indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego, któremu towarzyszy indukcja zarówno p16(INK4a), jak i związanej ze starzeniem się aktywności kwaśnej beta – galaktozydazy (SA -beta- Gal) , powszechnie stosowanej marker starzenia.
- Po walidacji tych wyników in vivo, znamiona wrodzone są niezmiennie pozytywne dla SA -beta- Gal, co wskazuje na obecność tego klasycznego markera związanego ze starzeniem się w przypadku zmiany nowotworowej u człowieka w dużej mierze z zahamowanym wzrostem. W melanocytach z zahamowanym wzrostem, zarówno in vitro, jak i in situ, zaobserwowaliśmy wyraźną mozaikową indukcję p16(INK4a), co sugeruje, że czynniki inne niż p16(INK4a) przyczyniają się do ochrony przed proliferacją sterowaną przez BRAF(V600E).
- Naevi nie wydaje się cierpieć z powodu ścierania się telomerów, argumentując za aktywnym procesem starzenia się, napędzanym przez onkogeny, a nie utratą potencjału replikacyjnego.
- Tak więc, zarówno in vitro, jak i in vivo, melanocyty z ekspresją BRAF(V600E) wykazują klasyczne cechy starzenia, co sugeruje, że starzenie się indukowane przez onkogen reprezentuje prawdziwy ochronny proces fizjologiczny.
Fuzje genów in vitro, które łączą aktywny enzymatycznie segment beta – galaktozydazy z fragmentami na końcu aminowym białek egzogennych: wektory plazmidowe Escherichia coli do wykrywania i klonowania sygnałów inicjacji translacji.
- Przedstawiamy konstrukcję i zastosowanie serii wektorów plazmidowych odpowiednich do wykrywania i klonowania sygnałów kontrolnych translacji i sekwencji kodujących 5′ genów pochodzenia egzogennego.
- W plazmidach tych usunięto pierwsze osiem kodonów końca aminowego genu beta – galaktozydazy operonu laktozy , lacZ, a unikalne miejsca cięcia endonukleaz BamHI, EcoRI i SmaI (XmaI) zostały włączone w sąsiedztwie ósmego kodonu lacZ.
- Wprowadzenie do takich plazmidów fuzyjnych lac fragmentów kwasu dezoksyrybonukleinowego zawierających odpowiednie sygnały regulatorowe i sekwencje kodujące 5′ doprowadziło do wytworzenia białek hybrydowych składających się z karboksylokońcowego segmentu pozostałości beta – galaktozydazy oraz fragmentu peptydu zawierającego aminokońcową grupę aminową kwasy kodowane przez egzogenną sekwencję kwasu dezoksyrybonukleinowego.
- Te peptydy hybrydowe zachowały aktywność enzymatyczną beta – galaktozydazy i dały fenotyp Lac+. Takie białka hybrydowe są przydatne do oczyszczania sekwencji peptydowych kodowanych przez egzogenne fragmenty kwasu dezoksyrybonukleinowego oraz do badań dotyczących struktury i funkcji określonych segmentów peptydowych.
Pułapki promotorowe w embrionalnych komórkach macierzystych: genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji i mutacji genów rozwojowych u myszy.
- Opracowano ogólną strategię selekcji mutacji insercyjnych u myszy. Konstrukty pozbawione promotora i zawierające gen beta – galaktozydazy lub gen reporterowy kodujący białko o aktywności zarówno beta – galaktozydazy , jak i fosfotransferazy neomycyny , zostały zaprojektowane tak, aby aktywacja genu reporterowego zależała od jego wstawienia w aktywną jednostkę transkrypcyjną. Takie zdarzenia insercyjne tworzą mutację w znakowanym genie i umożliwiają pójście za jego ekspresją aktywności beta – galaktozydazy .
- Wprowadzenie konstruktów pułapki promotorowej do embrionalnych komórek macierzystych (ES) przez elektroporację lub infekcję retrowirusową doprowadziło do wyprowadzenia linii transgenicznych, które wykazują różne wzorce ekspresji beta – galaktozydazy . Krzyżowanie heterozygot z 24 szczepów, w których zachodzi ekspresja beta – galaktozydazy , pozwoliło zidentyfikować 9 szczepów, w których homozygotyczność prowadzi do śmiertelności embrionalnej. Ponieważ w pozostałych szczepach nie wykryto jawnego fenotypu, wyniki te sugerują, że znaczna część genów ssaków zidentyfikowanych za pomocą tego podejścia nie jest niezbędna do rozwoju.
Mapowanie sygnalizacji Wnt/ beta- katenina podczas rozwoju myszy iw nowotworach jelita grubego.
- Sygnalizacja beta- kateniny Wnt odgrywa kluczową rolę w kilku procesach rozwojowych i patologicznych. Domeny ekspresji Wnt były szeroko badane u myszy, ale tkanki odbierające sygnał pozostają w dużej mierze niezidentyfikowane.
- Aby określić, które komórki reagują na aktywowaną beta- kateninę podczas rozwoju ssaków, wygenerowaliśmy transgen aktywowany przez beta -kateninę, kierujący ekspresją jądrowych myszy transgenicznych z receptorem beta – galaktozydazy (BAT-gal), eksprymujących gen lacZ pod kontrolą beta- kateniny T elementy reagujące na czynnik komórkowy.
- Aktywność genu reporterowego znajduje się w znanych ośrodkach organizacyjnych, takich jak granica śródmózgowia i ektodermalny grzbiet wierzchołka kończyny. Co więcej, ekspresja BAT-gal identyfikuje nowe miejsca sygnalizacji Wnt, takie jak struna grzbietowa, śródbłonek i obszary mózgu dorosłego, ujawniając nieoczekiwany dynamiczny wzór aktywności transkrypcyjnej beta- kateniny . Ekspresję transgenu analizowano na zmutowanych tłach.
- U homozygotycznych myszy 6-null związanych z receptorem lipoproteinowym, które nie mają koreceptora Wnt, barwienie BAT-gal nie występuje w zmutowanych tkankach, co wskazuje, że myszy BAT-gal są bona fide wskaźnikami sygnalizacji Wnt beta- kateniny in vivo.
- Analizy ekspresji BAT-gal w tle gruczolakowatej polipowatości jelita grubego (rozwój jelita grubego+) wykazały aktywność transkrypcyjną beta- kateniny w gruczolakach jelit, ale zaskakująco nie w normalnych komórkach krypt.
Beta Galactosidase (?-Gal) Activity Assay Kit (Fluorometric) |
|||
K821-100 | Biovision | each | 601.2 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
70C-CR7001CAP | Fitzgerald | 100 ug | 516 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
70R-10653 | Fitzgerald | 400 ul | 516 EUR |
beta-Galactosidase Antibody |
|||
5155-002mg | ProSci | 0.02 mg | 206.18 EUR |
beta-Galactosidase Antibody |
|||
5155-01mg | ProSci | 0.1 mg | 523.7 EUR |
beta-Galactosidase Peptide |
|||
5155P | ProSci | 0.05 mg | 197.7 EUR |
Beta galactosidase antibody |
|||
70R-51282 | Fitzgerald | 100 ul | 292.8 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
20C-CR7001RP | Fitzgerald | 1 mg | 117.6 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
20C-CR7001RP2 | Fitzgerald | 2 mg | 240 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
20C-CR7001RP5 | Fitzgerald | 5 mg | 326.4 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
20-BR21 | Fitzgerald | 2 mL | 568.8 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
20R-GR016 | Fitzgerald | 10 mg | 442.8 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
10C-CR7001M2 | Fitzgerald | 100 ug | 163.2 EUR |
beta Galactosidase antibody |
|||
10R-G122a | Fitzgerald | 1 mg | 398.4 EUR |
beta-Galactosidase Antibody |
|||
24889-100ul | SAB | 100ul | 468 EUR |
beta Galactosidase protein |
|||
30-AB21 | Fitzgerald | 1000 units | 258 EUR |
beta Galactosidase Enzyme |
|||
abx070004-100ug | Abbexa | 100 ug | 710.4 EUR |
Beta-Galactosidase Antibody |
|||
3231-100 | Biovision | each | 418.8 EUR |
Beta-Galactosidase Antibody |
|||
3231-30T | Biovision | each | 175.2 EUR |
Alpha Galactosidase (?-Gal) Activity Assay Kit (Fluorometric) |
|||
K407-100 | Biovision | each | 633.6 EUR |
Beta Galactosidase Staining Kit |
|||
55R-1541 | Fitzgerald | 250 assays | 444 EUR |
beta Galactosidase antibody (biotin) |
|||
60R-1083 | Fitzgerald | 2 mg | 165.6 EUR |
Anti-Galactosidase beta Antibody |
|||
A01829 | BosterBio | 100ul | 476.4 EUR |
beta-Galactosidase Recombinant Protein |
|||
91-428 | ProSci | 0.05 mg | 714.3 EUR |
beta Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx140220-01mg | Abbexa | 0.1 mg | 460.8 EUR |
beta Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
20-abx141121 | Abbexa |
|
|
beta Galactosidase Blocking Peptide |
|||
20-abx061819 | Abbexa |
|
|
beta Galactosidase Blocking Peptide |
|||
20-abx064157 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx101619 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx101620 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx101621 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta Polyclonal Antibody |
|||
ABP57427-003ml | Abbkine | 0.03ml | 189.6 EUR |
Galactosidase Beta Polyclonal Antibody |
|||
ABP57427-01ml | Abbkine | 0.1ml | 346.8 EUR |
Galactosidase Beta Polyclonal Antibody |
|||
ABP57427-02ml | Abbkine | 0.2ml | 496.8 EUR |
beta Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
20-abx007866 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
20-abx001538 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx122700-100ug | Abbexa | 100 ug | 469.2 EUR |
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
20-abx112659 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
20-abx014265 | Abbexa |
|
|
beta D Galactosidase Antibody |
|||
abx022826-10mg | Abbexa | 10 mg | 910.8 EUR |
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx029610-400ul | Abbexa | 400 ul | 627.6 EUR |
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx029610-80l | Abbexa | 80 µl | 343.2 EUR |
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody |
|||
20-abx333660 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx330975-100ul | Abbexa | 100 ul | 510 EUR |
Beta Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx230877-100ug | Abbexa | 100 ug | 610.8 EUR |
Beta-Galactosidase Assay Kit |
|||
abx298865-100Assays | Abbexa | 100 Assays | 679.2 EUR |
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
20-abx302353 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
20-abx324974 | Abbexa |
|
|
beta Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx415199-02mg | Abbexa | 0.2 mg | 678 EUR |
beta Galactosidase (GLB1) Antibody |
|||
abx411927-01mg | Abbexa | 0.1 mg | 710.4 EUR |
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx172501 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx176533 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx176534 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx176535 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody |
|||
20-abx176536 | Abbexa |
|
|
Anti-Beta galactosidase antibody |
|||
PAab00877 | Lifescience Market | 100 ug | 463.2 EUR |
anti- Beta galactosidase antibody |
|||
FNab00877 | FN Test | 100µg | 658.5 EUR |
Beta-Galactosidase Staining Kit |
|||
K2182-250 | ApexBio | 250 assays | 351.6 EUR |
Recombinant Galactosidase Beta (GLb) |
|||
4-RPA196Hu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Galactosidase Beta (GLb) |
|||
4-RPA196Mu01 | Cloud-Clone |
|
|
Recombinant Galactosidase Beta (GLb) |
|||
4-RPA196Ra01 | Cloud-Clone |
|
|
Anti-Galactosidase beta antibody |
|||
STJ97628 | St John's Laboratory | 200 µl | 236.4 EUR |
Beta-Galactosidase Staining Kit |
|||
K802-250 | Biovision | each | 352.8 EUR |
Recombinant E.coli Galactosidase-Beta 1 |
|||
7-02812 | CHI Scientific | 10µg | Ask for price |
Recombinant E.coli Galactosidase-Beta 1 |
|||
7-02813 | CHI Scientific | 50µg | Ask for price |
Recombinant E.coli Galactosidase-Beta 1 |
|||
7-02814 | CHI Scientific | 1mg | Ask for price |
Anti-GLB1/Beta-galactosidase Antibody |
|||
A01829-2 | BosterBio | 100ug/vial | 400.8 EUR |
Anti-GLB1/Beta-galactosidase Antibody |
|||
A01829-3 | BosterBio | 100ug/vial | 400.8 EUR |
Human Galactosidase Beta (GLb) Protein |
|||
20-abx066717 | Abbexa |
|
|
Mouse Galactosidase Beta (GLb) Protein |
|||
20-abx066718 | Abbexa |
|
|
Rat Galactosidase Beta (GLb) Protein |
|||
20-abx066719 | Abbexa |
|
|
E.coli Galactosidase beta 1 (Recombinant) |
|||
20-abx073044 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody (HRP) |
|||
20-abx333661 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody (FITC) |
|||
20-abx333662 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (LACZ) Antibody (Biotin) |
|||
20-abx333663 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody (FITC) |
|||
20-abx273830 | Abbexa |
|
|
Galactosidase Beta (GLb) Antibody (Biotin) |
|||
20-abx271946 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody (HRP) |
|||
20-abx316908 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody (FITC) |
|||
20-abx316909 | Abbexa |
|
|
Beta-Galactosidase (GLB1) Antibody (Biotin) |
|||
20-abx316910 | Abbexa |
|
|
Bacteria beta Galactosidase (GLB1) Protein |
|||
abx670038-5mg | Abbexa | 5 mg | 526.8 EUR |
Cow Galactosidase Beta (GLb) Protein |
|||
20-abx653492 | Abbexa |
|
|
Dog Galactosidase Beta (GLb) Protein |
|||
20-abx653493 | Abbexa |
|
|
Zebrafish Galactosidase Beta (GLb) Protein |
|||
20-abx653494 | Abbexa |
|
|
Monkey Galactosidase Beta (GLb) Protein |
|||
20-abx653495 | Abbexa |
|
|
Anti-Galactosidase beta L3 antibody |
|||
STJ93200 | St John's Laboratory | 200 µl | 236.4 EUR |
Human beta-galactosidase(beta-GAL)ELISA Kit |
|||
YLA0572HU-48T | Shanghai YL Biotech | 48T | 435 EUR |
Human beta-galactosidase(beta-GAL)ELISA Kit |
|||
YLA0572HU-96T | Shanghai YL Biotech | 96T | 562.5 EUR |
Beta Secretase Activity Assay Kit |
|||
55R-1383 | Fitzgerald | 100 assays | 1002 EUR |
Beta Hexosaminidase Activity Assay Kit |
|||
MET-5095 | Cell Biolabs | 100 assays | 609.6 EUR |
Anti-beta-Galactosidase (E. coli) Purified |
|||
11-261-C025 | ExBio | 0.025 mg | 129.6 EUR |
Anti-beta-Galactosidase (E. coli) Purified |
|||
11-261-C100 | ExBio | 0.1 mg | 212.4 EUR |
Human Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit |
|||
20-abx151616 | Abbexa |
|
|
Human Galactosidase Beta (GLb) CLIA Kit |
|||
abx196673-96tests | Abbexa | 96 tests | 990 EUR |
Mouse beta-Galactosidase (bGAL) CLIA Kit |
|||
abx196748-96tests | Abbexa | 96 tests | 990 EUR |
Mouse Galactosidase, Beta (GLb) CLIA Kit |
|||
abx196965-96tests | Abbexa | 96 tests | 990 EUR |
Rat Galactosidase, Beta (GLb) CLIA Kit |
|||
abx196966-96tests | Abbexa | 96 tests | 990 EUR |
Rabbit Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit |
|||
abx362799-96tests | Abbexa | 96 tests | 990 EUR |
Sheep Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit |
|||
abx364708-96tests | Abbexa | 96 tests | 1111.2 EUR |
Pig Beta-Galactosidase (GLB1) ELISA Kit |
|||
abx361402-96tests | Abbexa | 96 tests | 990 EUR |
Podsumowując, myszy BAT-gal ujawniają całą złożoność sygnalizacji beta- kateniny Wnt u ssaków i mają szerokie możliwości zastosowania do identyfikacji populacji komórek reagujących na Wnt w rozwoju i chorobie.