Chi Kwadrat naukowe badania biotechnologiczne z Instytutu Socjologii Uniwersytetu

Konwersja trypsyny do chymotrypsyny

• Pawel
• 9 czerwca, 202210 czerwca, 2022
• 0

Trypsyna II szczura została przekształcona w proteazę o specyficzności substratowej podobnej do chymotrypsyny [Hedstrom, L., et al. (1994) Biochemia (poprzedni artykuł w tym numerze)]. Kluczową zmianą w tej konwersji jest wymiana dwóch pętli powierzchniowych na analogiczne pętle chymotrypsyny. k(inact)/Ki dla inaktywacji chymotrypsyny, trypsyny, mutanta trypsyny o słabej aktywności (D189S) i mutantów chymotrypsynopodobnych Tr->>Ch[S1+L1+L2] i Tr->>Ch[S1 +L1+L2+Y172W] przez  Suc – Ala – Ala – Pro – Phe -chlorometyloketon koreluje z kcat/Km dla hydrolizy  Suc – Ala – Ala – Pro – Phe– AMC . k(inact) dla inaktywacji Tr->>Ch[S1+L1+L2] i Tr->>Ch[S1+L1+L2+Y172W] są porównywalne do tych dla chymotrypsyny, podczas gdy Ki były znacznie wyższe. Ki dla hamowania tych enzymów przez analog stanu przejściowego MeO Suc – Ala – Ala – Pro – boro- Phe  koreluje również z kcat/Km dla hydrolizy  Suc – Ala – Ala – Pro – Phe – AMC .

Wyniki te sugerują, że pętle powierzchniowe stabilizują stan przejściowy hydrolizy substratów chymotrypsyny poprzez poprawę orientacji związanych substratów względem reszt katalitycznych. Wreszcie, trypsyna i chymotrypsyna mają porównywalne powinowactwo do proflawiny, podczas gdy Kd dla kompleksu Tr->>Ch[S1+L1+L2+Y172W]-proflawina jest 10-krotnie wyższa. Nie zaobserwowano wiązania proflawiny ani dla D189S, ani dla Tr->>Ch-[S1+L1+L2], co sugeruje, że kieszenie wiążące S1 tych dwóch zmutowanych enzymów są zdeformowane. Praca ta potwierdza, że ​​specyficzność enzymatyczna jest wyrażana w chemicznych etapach reakcji, a nie w wiązaniu substratu.