Konwersja trypsyny do chymotrypsyny
Pawel
- 0
Trypsyna II szczura została przekształcona w proteazę o specyficzności substratowej podobnej do chymotrypsyny [Hedstrom, L., et al. (1994) Biochemia (poprzedni artykuł w tym numerze)]. Kluczową zmianą w tej konwersji jest wymiana dwóch pętli powierzchniowych na analogiczne pętle chymotrypsyny. k(inact)/Ki dla inaktywacji chymotrypsyny, trypsyny, mutanta trypsyny o słabej aktywności (D189S) i mutantów chymotrypsynopodobnych Tr->>Ch[S1+L1+L2] i Tr->>Ch[S1 +L1+L2+Y172W] przez Suc – Ala – Ala – Pro – Phe -chlorometyloketon koreluje z kcat/Km dla hydrolizy Suc – Ala – Ala – Pro – Phe– AMC . k(inact) dla inaktywacji Tr->>Ch[S1+L1+L2] i Tr->>Ch[S1+L1+L2+Y172W] są porównywalne do tych dla chymotrypsyny, podczas gdy Ki były znacznie wyższe. Ki dla hamowania tych enzymów przez analog stanu przejściowego MeO Suc – Ala – Ala – Pro – boro- Phe koreluje również z kcat/Km dla hydrolizy Suc – Ala – Ala – Pro – Phe – AMC .
Wyniki te sugerują, że pętle powierzchniowe stabilizują stan przejściowy hydrolizy substratów chymotrypsyny poprzez poprawę orientacji związanych substratów względem reszt katalitycznych. Wreszcie, trypsyna i chymotrypsyna mają porównywalne powinowactwo do proflawiny, podczas gdy Kd dla kompleksu Tr->>Ch[S1+L1+L2+Y172W]-proflawina jest 10-krotnie wyższa. Nie zaobserwowano wiązania proflawiny ani dla D189S, ani dla Tr->>Ch-[S1+L1+L2], co sugeruje, że kieszenie wiążące S1 tych dwóch zmutowanych enzymów są zdeformowane. Praca ta potwierdza, że specyficzność enzymatyczna jest wyrażana w chemicznych etapach reakcji, a nie w wiązaniu substratu.
Trawienna aktywność proteolityczna u szkodnika Sunn, Eurygaster integriceps.
- Szkodnik Sunn Eurygaster integriceps Puton (Heteroptera: Scutelleridae) jest jednym z najważniejszych szkodników pszenicy i corocznie powoduje znaczne szkody w tej cennej uprawie. Aktywność proteinazy trawiennej dorosłych owadów badano przy użyciu ogólnych i specyficznych substratów i inhibitorów. Aktywność proteolityczna była niska, gdy do badania gruczołów ślinowych i jelita środkowego stosowano typowe substraty konwencjonalne, azoalbuminę, azokazeinę i hemoglobinę .
- Stosując fluorescencyjny substrat kazeinowy (kazeina BODIPY FL), zmierzono całkowitą aktywność proteolityczną przy różnym pH. Maksymalną aktywność proteolityczną wykryto przy pH 7 (100%) i 8(65%), co sugerowało obecność proteinaz serynowych w gruczołach ślinowych. Nie było wykrywalnej aktywności proteolitycznej w ekstraktach z jelita środkowego.
- Inhibitory; PMSF (inhibitor proteinaz serynowych) i TPCK (specyficzny inhibitor chymotrypsyny) wykazały ponad 50% działanie hamujące na całkowitą aktywność proteolityczną, jednak TLCK (specyficzny inhibitor trypsyny) i E-64 (specyficzny inhibitor proteinazy cysteinowej) nie hamowały całkowitej proteolitycznej działalność. Użycie fluorescencyjnych substratów specyficznych dla proteinaz serynowych i cysteinowych (Z -Arg- AMC , Z-Arg-Arg- AMC , Z-Arg- Phe – AMC i Suc – Ala – Ala – Pro – Phe -AMZ) ujawniło obecność trypsyny i aktywność chymotryptyczna w ekstrakcie gruczołu ślinowego.
- Analiza zymogramu w nieredukujących warunkach SDS-PAGE i przy użyciu substratu APNE wykazała co najmniej 8 prążków aktywności trypsynowej i chymotryptycznej w ekstraktach gruczołów ślinowych. Pojedynczy prążek o wysokiej masie cząsteczkowej o aktywności trypsyny (165 kDa) wykryto przy użyciu substratu BApNA w analizie zymogramu przy użyciu natywnej PAGE. Badania kinetyczne wykazały wartość ak(m) 0,6 mM dla tego enzymu w stosunku do substratu BApNA.
- Inhibitor TLCK zmniejszył aktywność enzymu podobnego do trypsyny do 73% i prawie całkowicie wyeliminował jedyne w zymogramie pasmo związane z tą proteinazą. Inhibitor trypsyny typu Kunitz z soi nie wykazywał wpływu na aktywność proteolityczną trypsynopodobnej proteinazy serynowej. Ogólnie wyniki wykazały obecność chymotrypsyno- i trypsynopodobnych proteinaz serynowych w gruczole ślinowym E. integriceps i wydaje się, że główna całkowita aktywność proteolityczna jest spowodowana proteinazami chymotrypsynowymi.
Wykrywanie aktywności proteolitycznej za pomocą fluorescencyjnych zymogramów w żelu.
- Protezy biorą udział w regulacji wielu funkcji biologicznych. Niniejsze badanie opisuje nową metodę wykrywania aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnych zymogramów w testach proteazy w żelu, przy użyciu żeli poliakrylamidowych SDS skopolimeryzowanych z substratem peptyd-MCA (4-metylokumarylo-7-amid).
- Metoda ta pozwala na jednoczesne określenie swoistości cięcia proteaz i masy cząsteczkowej. Trypsynę poddano elektroforezie w żelach poliakrylamidowych SDS skopolimeryzowanych z Boc-Gln- Ala -Arg-MCA, żel następnie inkubowano w buforze testowym, a cięcie trypsyną substratu peptyd-MCA generowało fluorescencyjne AMC (7-amino-4-metylo-kumarynę ), który został następnie wykryty w świetle transiluminacyjnym UV.
- Aktywność chymotrypsyny wykryto w żelach skopolimeryzowanych z substratem Suc – Ala – Ala – Pro – Phe –MCA. Selektywne wykrywanie tych proteaz wykazano przez brak aktywności trypsyny w żelach zawierających substrat chymotrypsyny i brak aktywności chymotrypsyny w żelach zawierających substrat trypsyny.
- Wykrywanie aktywności proteolitycznej z pęcherzyków wydzielniczych rdzenia nadnerczy (ziarnistości chromafiny) obserwowano dla substratu trypsyny, Z – Phe -Arg-MCA, ale nie dla substratu chymotrypsyny.
- Ogólnie rzecz biorąc, ta czuła metoda fluorescencyjnego zymogramu w żelu oznaczania proteazy może być stosowana do szybkiego oznaczania swoistości cięcia proteazy i masy cząsteczkowej enzymu w próbkach biologicznych. Test ten powinien być przydatny w wielu dyscyplinach badawczych badających rolę wielu proteaz kontrolujących funkcje komórkowe.
Odwrócona zymografia z użyciem substratów fluorogennych do wykrywania inhibitorów proteaz.
- Opisano nową, czułą metodę wykrywania inhibitorów proteazy przy użyciu fluorescencyjnych substratów proteaz w żelach. Inhibitory proteazy rozdzielono na żelach poliakrylamidowych dodecylosiarczanu sodu (SDS) zawierających skopolimeryzowany substrat peptydowy, mianowicie 4-metylokumarylo-7-amid (MCA). Jako substraty włączone do żelu zastosowano Boc – Phe Ser-Arg-MCA dla trypsyny, Suc – Ala – Ala – Pro – Phe -MCA dla alfa-chymotrypsyny i Z – Phe -Arg-MCA dla papainy.
- Po elektroforezie, przemycie i inkubacja żelu z roztworami docelowej proteazy umożliwiło rozszczepienie substratu przez proteazę i uwolnienie fluorescencyjnej 7-amino-4-metylokumaryny ( AMC ), którą wykryto w transiluminatorze UV.
- Nierozszczepiony substrat peptyd-MCA pozostał tam, gdzie obecne były inhibitory i został uwidoczniony jako ciemnoniebieskie pasma na jasnozielonym fluorescencyjnym żelu tła.
- Ta nowa metoda oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi poprzednimi metodami, w tym:
- (i) znacznie zwiększoną czułość można osiągnąć w krótszym czasie, co może być przydatne do odkrywania nowych inhibitorów proteazy w małych ilościach surowego materiału.
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC |
|||
I-1465.0050 | Bachem | 50.0mg | 471.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC |
|||
I-1465.0250 | Bachem | 250.0mg | 1778.4 EUR |
Suc-Ala-Ala-Phe-AMC |
|||
I-1315.0050 | Bachem | 50.0mg | 471.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Phe-AMC |
|||
I-1315.0250 | Bachem | 250.0mg | 1778.4 EUR |
Suc-Ala-Pro-Ala-AMC |
|||
I-1335.0050 | Bachem | 50.0mg | 819.6 EUR |
Suc-Ala-Pro-Ala-AMC |
|||
I-1335.0250 | Bachem | 250.0mg | 3170.4 EUR |
Suc-Ala-Leu-Pro-Phe-AMC |
|||
I-1695.0050 | Bachem | 50.0mg | 471.6 EUR |
Suc-Ala-Leu-Pro-Phe-AMC |
|||
I-1695.0250 | Bachem | 250.0mg | 1778.4 EUR |
Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-AMC |
|||
I-1750.0050 | Bachem | 50.0mg | 1009.2 EUR |
Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-AMC |
|||
I-1750.0250 | Bachem | 250.0mg | 3924 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC |
|||
I-1490.0050 | Bachem | 50.0mg | 1009.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC |
|||
I-1490.0250 | Bachem | 250.0mg | 3924 EUR |
Suc-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1325.0050 | Bachem | 50.0mg | 792 EUR |
Suc-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1325.0250 | Bachem | 250.0mg | 3054 EUR |
Suc-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1330.0050 | Bachem | 50.0mg | 792 EUR |
Suc-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1330.0250 | Bachem | 250.0mg | 3054 EUR |
Suc-Ala-Ala-Ala-AMC |
|||
I-1310.0050 | Bachem | 50.0mg | 792 EUR |
Suc-Ala-Ala-Ala-AMC |
|||
I-1310.0250 | Bachem | 250.0mg | 3054 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-SBzl |
|||
M-1735.0050 | Bachem | 50.0mg | 1052.4 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-SBzl |
|||
M-1735.0250 | Bachem | 250.0mg | 4099.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1400.0050 | Bachem | 50.0mg | 181.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1400.0250 | Bachem | 250.0mg | 471.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1400.1000 | Bachem | 1.0g | 1341.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Val-AMC |
|||
I-1320.0050 | Bachem | 50.0mg | 1009.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Val-AMC |
|||
I-1320.0250 | Bachem | 250.0mg | 3924 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-2,4-difluoroanilide |
|||
M-2305.0050 | Bachem | 50.0mg | 1009.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-2,4-difluoroanilide |
|||
M-2305.0250 | Bachem | 250.0mg | 3924 EUR |
Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1605.0050 | Bachem | 50.0mg | 544.8 EUR |
Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1605.0250 | Bachem | 250.0mg | 2067.6 EUR |
Suc-Phe-Ala-Ala-Phe-pNA |
|||
L-1675.0050 | Bachem | 50.0mg | 181.2 EUR |
Suc-Phe-Ala-Ala-Phe-pNA |
|||
L-1675.0250 | Bachem | 250.0mg | 471.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA |
|||
L-1775.0250 | Bachem | 250.0mg | 792 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA |
|||
L-1775.1000 | Bachem | 1.0g | 2300.4 EUR |
Suc-Ala-Ala-Phe-pNA |
|||
L-1580.0250 | Bachem | 250.0mg | 1052.4 EUR |
Suc-Ala-Ala-Phe-pNA |
|||
L-1580.1000 | Bachem | 1.0g | 3082.8 EUR |
Suc-Ala-Gly-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1590.0050 | Bachem | 50.0mg | 327.6 EUR |
Suc-Ala-Gly-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1590.0250 | Bachem | 250.0mg | 1197.6 EUR |
Suc-Ala-His-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1595.0050 | Bachem | 50.0mg | 544.8 EUR |
Suc-Ala-His-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1595.0250 | Bachem | 250.0mg | 2067.6 EUR |
Suc-Ala-Gln-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1600.0050 | Bachem | 50.0mg | 849.6 EUR |
Suc-Ala-Gln-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1600.0250 | Bachem | 250.0mg | 3286.8 EUR |
Suc-Ala-Leu-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1620.0050 | Bachem | 50.0mg | 327.6 EUR |
Suc-Ala-Leu-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1620.0250 | Bachem | 250.0mg | 1197.6 EUR |
Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1625.0050 | Bachem | 50.0mg | 691.2 EUR |
Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1625.0250 | Bachem | 250.0mg | 2648.4 EUR |
Suc-Ala-Lys-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1630.0050 | Bachem | 50.0mg | 849.6 EUR |
Suc-Ala-Lys-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1630.0250 | Bachem | 250.0mg | 3286.8 EUR |
Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1635.0050 | Bachem | 50.0mg | 675.6 EUR |
Suc-Ala-Glu-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1635.0250 | Bachem | 250.0mg | 2590.8 EUR |
Suc-Ala-Ile-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1665.0050 | Bachem | 50.0mg | 691.2 EUR |
Suc-Ala-Ile-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1665.0250 | Bachem | 250.0mg | 2648.4 EUR |
Suc-Ala-Trp-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1670.0050 | Bachem | 50.0mg | 849.6 EUR |
Suc-Ala-Trp-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1670.0250 | Bachem | 250.0mg | 3286.8 EUR |
Glutaryl-Phe-Ala-Ala-Phe-AMC |
|||
I-1535.0025 | Bachem | 25.0mg | 849.6 EUR |
Glutaryl-Phe-Ala-Ala-Phe-AMC |
|||
I-1535.0100 | Bachem | 100.0mg | 2473.2 EUR |
Ac-Ala-Ala-Pro-Ala-AMC |
|||
I-1000.0050 | Bachem | 50.0mg | 792 EUR |
Ac-Ala-Ala-Pro-Ala-AMC |
|||
I-1000.0250 | Bachem | 250.0mg | 3054 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA |
|||
L-1390.0050 | Bachem | 50.0mg | 181.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA |
|||
L-1390.0250 | Bachem | 250.0mg | 471.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA |
|||
L-1390.1000 | Bachem | 1.0g | 1341.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA |
|||
L-1395.0050 | Bachem | 50.0mg | 400.8 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA |
|||
L-1395.0250 | Bachem | 250.0mg | 1416 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Glu-pNA |
|||
L-1710.0050 | Bachem | 50.0mg | 675.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Glu-pNA |
|||
L-1710.0250 | Bachem | 250.0mg | 2590.8 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA |
|||
L-1720.0050 | Bachem | 50.0mg | 792 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA |
|||
L-1720.0250 | Bachem | 250.0mg | 3054 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Lys-pNA |
|||
L-1725.0050 | Bachem | 50.0mg | 675.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Lys-pNA |
|||
L-1725.0250 | Bachem | 250.0mg | 2590.8 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA |
|||
L-1770.0250 | Bachem | 250.0mg | 792 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA |
|||
L-1770.1000 | Bachem | 1.0g | 2300.4 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Nva-pNA |
|||
L-1780.0250 | Bachem | 250.0mg | 849.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Nva-pNA |
|||
L-1780.1000 | Bachem | 1.0g | 2474.4 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Ile-pNA |
|||
L-1790.0250 | Bachem | 250.0mg | 1009.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Ile-pNA |
|||
L-1790.1000 | Bachem | 1.0g | 2953.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Asp-pNA |
|||
L-1835.0050 | Bachem | 50.0mg | 849.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Asp-pNA |
|||
L-1835.0250 | Bachem | 250.0mg | 3286.8 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-pNA |
|||
L-2160.0500 | Bachem | 0.5mg | 72 EUR |
Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-pNA |
|||
L-2160.1000 | Bachem | 1.0mg | 99.6 EUR |
Suc-Ala-Pro-pNA |
|||
L-2090.0050 | Bachem | 50.0mg | 544.8 EUR |
Suc-Ala-Pro-pNA |
|||
L-2090.0250 | Bachem | 250.0mg | 2067.6 EUR |
MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC |
|||
I-1270.0050 | Bachem | 50.0mg | 471.6 EUR |
MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC |
|||
I-1270.0250 | Bachem | 250.0mg | 1778.4 EUR |
MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-AMC |
|||
I-1405.0050 | Bachem | 50.0mg | 1009.2 EUR |
MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-AMC |
|||
I-1405.0250 | Bachem | 250.0mg | 3924 EUR |
H-Ala-Ala-Phe-AMC (free base) |
|||
I-1415.0050 | Bachem | 50.0mg | 181.2 EUR |
H-Ala-Ala-Phe-AMC (free base) |
|||
I-1415.0250 | Bachem | 250.0mg | 618 EUR |
Suc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-pNA |
|||
L-1325.0025 | Bachem | 25.0mg | 849.6 EUR |
Suc-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-pNA |
|||
L-1325.0100 | Bachem | 100.0mg | 2473.2 EUR |
Suc-Ala-Ala-Ala-pNA |
|||
L-1385.0250 | Bachem | 250.0mg | 270 EUR |
Suc-Ala-Ala-Ala-pNA |
|||
L-1385.1000 | Bachem | 1.0g | 733.2 EUR |
Ac-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1010.0050 | Bachem | 50.0mg | 691.2 EUR |
Ac-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA |
|||
L-1010.0250 | Bachem | 250.0mg | 2648.4 EUR |
Suc-Ala-Ala-pNA |
|||
L-1505.0250 | Bachem | 250.0mg | 270 EUR |
Suc-Ala-Ala-pNA |
|||
L-1505.1000 | Bachem | 1.0g | 733.2 EUR |
H-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1045.0050 | Bachem | 50.0mg | 792 EUR |
H-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1045.0250 | Bachem | 250.0mg | 3054 EUR |
MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1275.0050 | Bachem | 50.0mg | 792 EUR |
MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC |
|||
I-1275.0250 | Bachem | 250.0mg | 3054 EUR |
Suc-APA-pNA peptide [Suc-Ala-Pro-Ala-pNA; MW: 477.5] |
|||
SP-51205-1 | Alpha Diagnostics | 1 mg | 169.2 EUR |
Ac-Pro-Ala-Leu-AMC |
|||
13479 | AAT Bioquest | 5 mg | 158.4 EUR |
- (ii) procedura jest dość prosta i szybka, ponieważ okres inkubacji jest bardzo krótki i etapy barwienia i odbarwiania nie są potrzebne;
- (iii) ponieważ sondy te wykorzystują specyficzność substratową/proteazy docelowe, są doskonałymi narzędziami do wykrywania i rozróżniania nieznanych inhibitorów proteaz dla różnych proteaz docelowych.